星空体育- 星空体育官方网站- 世界杯指定平台镍合纳米磁珠纯化His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原的方法pdf

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　　2、07K 1/14(2006.01) (54)发明名称 镍合纳米磁珠纯化His-tag标记的口蹄疫表 位蛋白抗原的方法 (57)摘要 本发明提供镍合纳米磁珠纯化His-tag标记 的口蹄疫表位蛋白抗原的方法， 包括如下步骤： 取50L的镍合-NTA纳米磁珠放入离心管中， 加 入500l结合液， 混合10次， 磁力架吸附1min， 移 出并弃掉上清液， 重复洗涤1次； 将1mL结合液和 100LHis-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原加 入到上述离心管中， 4混合反应15min， 磁力架 吸附1min， 移出并弃掉上清液； 加入1mL洗涤液， 混合均匀， 室温放置5min， 磁力架吸附2min， 移。

　　3、出 并弃掉上清液， 重复1次； 加入200L洗脱液， 4 下混合10min， 磁力架吸附2min， 得到纯化富集后 的His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原上清液。 本发明的镍-NTA纳米抗体磁珠法纯化抗原具有 得率高， 抗原浓度大， 易于下游应用等优势。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 109851663 A 2019.06.07 CN 109851663 A 1.镍合纳米磁珠纯化His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原的方法， 其特征在于， 包括如 下步骤： 步骤一： 取50 L的镍合-NTA纳米磁珠放入1.5mL离心管中， 将500 l结合液， 加入到镍 合-NTA纳米磁珠中，。

　　4、 混合10次， 将上述离心管放在磁力架上进行吸附镍合-NTA纳米磁珠， 吸 附1min， 移出并弃掉上清液， 重复洗涤1次， 保留底部镍合-NTA纳米磁珠； 步骤二： 将1mL结合液和100 L His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原加入到步骤一中得 到镍合-NTA纳米磁珠的离心管中， 4混合反应15min， 把离心管放到磁力架上吸附1min， 移 出并弃掉上清液， 保留离心管底部的抗原-抗体磁珠结合物A； 步骤三： 加入1mL洗涤液洗涤步骤二中得到的抗原-抗体磁珠结合物A， 混合均匀， 室温 放置5min， 将离心管放到磁力架上吸附2min， 移出并弃掉上清液， 重复1次， 得到离心管底部 。

　　5、的抗原-抗体磁珠结合物B； 步骤四： 将200 L洗脱液加入到步骤三中获得抗原-抗体磁珠结合物B的离心管中， 4 下混合10min， 将离心管放到磁力架上吸附2min， 得到纯化富集后的His-tag标记的口蹄疫 表位蛋白抗原上清液。 2.根据权利要求1所述的镍合纳米磁珠纯化His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原的方 法， 其特征在于， 所述结合液为含有1-7mmol/L咪唑溶液、 0.2-0.8mol/L NaCl溶液、 10- 50mmol/L Tris-HCl pH7-8的缓冲液或pH7-8的HEPES缓冲液。 3.根据权利要求1所述的镍合纳米磁珠纯化His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗。

　　7、的口蹄疫表位蛋白抗原的 方法 技术领域 0001 本发明是镍合纳米磁珠纯化His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原的方法， 属于抗 原纯化技术领域。 背景技术 0002 镍-NTA纳米磁珠因其具有比表面积大、 吸附能力强、 易于自动化、 操作快速， 提取 高效等优势越来越广泛用于His-tag蛋白的纯化分离。 常用的分离柱法因其所需的操作时 间长、 获得的抗原浓度及得率低等不足而增加生产成本、 造成资源浪费。 发明内容 0003 针对现有技术存在的不足， 本发明目的是提供镍合纳米磁珠纯化His-tag标记的 口蹄疫表位蛋白抗原的方法， 以解决上述背景技术中提出的问题， 本发明的His-tag标记。

　　8、的 口蹄疫表位蛋白抗原得率高， 而且可以根据抗原的含量调整镍合-NTA纳米磁珠的用量， 节 省成本。 0004 为了实现上述目的， 本发明是通过如下的技术方案来实现： 镍合纳米磁珠纯化 His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原的方法， 包括如下步骤： 0005 步骤一： 取50 L的镍合-NTA纳米磁珠放入1.5mL离心管中， 将500 l结合液， 加入到 镍合-NTA纳米磁珠中， 混合10次， 将上述离心管放在磁力架上进行吸附镍合-NTA纳米磁珠， 吸附1min， 移出并弃掉上清液， 重复洗涤1次， 保留底部镍合-NTA纳米磁珠； 该步骤是为了优 化镍合-NTA纳米磁珠的结合环境。 0006 。

　　9、步骤二： 将1mL结合液和100 L His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原加入到步骤一 中得到镍合-NTA纳米磁珠的离心管中， 4混合反应15min， 把离心管放到磁力架上吸附 1min， 移出并弃掉上清液， 保留离心管底部的抗原-抗体磁珠结合物A， 该步骤加入结合液能 够更好地促进His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原和抗体的结合， 4低温可以更好地保护 His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原不被环境条件破坏， 通过上述抗体磁珠充分捕获His- tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原； 0007 步骤三： 加入1mL洗涤液洗涤步骤二中得到的抗原-抗体磁珠结合物A， 混合均匀， 室温放置5min， 。

　　10、将离心管放到磁力架上吸附2min， 移出并弃掉上清液， 重复1次， 得到离心管 底部的抗原-抗体磁珠结合物B； 该步骤加入洗涤液能够充分地去掉抗原-抗体磁珠结合物A 表面的非特异性结合的杂质。 0008 步骤四： 将200 L洗脱液加入到步骤三中获得抗原-抗体磁珠结合物B的离心管中， 4下混合10min， 将离心管放到磁力架上吸附2min， 得到纯化富集后的His-tag标记的口蹄 疫表位蛋白抗原上清液； 该步骤加入洗脱液目的是解离抗体磁珠捕获的His-tag标记的口 蹄疫表位蛋白抗原。 0009 进一步的， 所述结合液为含有1-7mmol/L咪唑溶液、 0.2-0.8mol/L NaCl溶液。

　　12、： 0013 (1)本发明的镍合-NTA纳米磁珠比表面积比微米磁珠大几个数量级， 单位体积的 吸附能力更优； 镍合-NTA纳米磁珠磁强度比微米磁珠大几倍， 故不易丢失样品， 更适合自动 化操作； 本发明操作简单、 操作时间短、 得率高， 且镍合-NTA纳米磁珠中具有能够与His-tag 标记的口蹄疫表位蛋白抗原结合的镍-NTA元素， 镍合-NTA纳米磁珠与His-tag标记的口蹄 疫表位蛋白抗原通过亲和力非共价结合。 0014 (2)本发明的镍合-NTA纳米磁珠与His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原可以在液 相通过混合充分接触， 使得镍合-NTA纳米磁珠捕获抗原的能力提升2-5倍； 由于镍合。

　　13、-NTA纳 米磁珠法不需要过滤柱， 因此避免了过滤柱的预处理， 超大的柱体积与样品比例以及大体 积的洗脱液稀释样品的问题； 洗脱液里通常含有高浓度盐咪唑， 在下步应用前需要透析或 柱层析去除咪唑。 镍合-NTA纳米磁珠获得的抗原浓度高， 可以通过稀释降低咪唑的含量， 而 不需要透析或柱层析。 0015 (3)本发明大约需要1小时， 得率比常规的分离柱法高3倍左右； 且镍合-NTA纳米磁 珠在使用前不需要耗时的预处理； 抗原分离过程中不需要连续测试和跟踪洗脱液； 可以根 据抗原的含量调整镍合-NTA纳米磁珠的用量， 节省成本。 0016 (4)本发明的镍-NTA纳米抗体磁珠法纯化抗原具有得率高，。

　　14、 抗原浓度大， 易于下游 应用等优势。 附图说明 0017 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述， 本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显： 0018 图1为本发明镍合纳米磁珠纯化His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原的方法的电 泳实验示意图。 具体实施方式 0019 为使本发明实现的技术手段、 创作特征、 达成目的与功效易于明白了解， 下面结合 具体实施方式， 进一步阐述本发明。 0020 实施例1 0021 取50 L的镍合-NTA纳米磁珠放入1.5mL离心管中， 将500 l结合液， 加入到镍合- NTA纳米磁珠中， 混合10次， 将上述离心管放在磁力架上进行吸附镍合。

　　15、-NTA纳米磁珠， 吸附 1min， 移出并弃掉上清液， 重复洗涤1次， 保留底部镍合-NTA纳米磁珠； 将1mL结合液和100 L His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原加入到镍合-NTA纳米磁珠的离心管中， 4混合反应 15min， 把离心管放到磁力架上吸附1min， 移出并弃掉上清液， 保留离心管底部的抗原-抗体 磁珠结合物A， 加入1mL洗涤液洗涤抗原-抗体磁珠结合物A， 混合均匀， 室温放置5min， 将离 说明书 2/5 页 4 CN 109851663 A 4 心管放到磁力架上吸附2min， 移出并弃掉上清液， 重复1次， 得到离心管底部的抗原-抗体磁 珠结合物B， 将200 L。

　　17、500 l结合液， 加入到镍合- NTA纳米磁珠中， 混合10次， 将上述离心管放在磁力架上进行吸附镍合-NTA纳米磁珠， 吸附 1min， 移出并弃掉上清液， 重复洗涤1次， 保留底部镍合-NTA纳米磁珠； 将1mL结合液和100 L His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原加入到镍合-NTA纳米磁珠的离心管中， 4混合反应 15min， 把离心管放到磁力架上吸附1min， 移出并弃掉上清液， 保留离心管底部的抗原-抗体 磁珠结合物A， 加入1mL洗涤液洗涤抗原-抗体磁珠结合物A， 混合均匀， 室温放置5min， 将离 心管放到磁力架上吸附2min， 移出并弃掉上清液， 重复1次， 得到离心管。

　　18、底部的抗原-抗体磁 珠结合物B， 将200 L洗脱液加入到上述离心管中， 4下混合10min， 将离心管放到磁力架上 吸附2min， 得到纯化富集后的His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原上清液。 0027 本实施例中， 结合液为pH8的HEPES缓冲液。 0028 本实施例中， 洗涤液为含有20mmol/L咪唑溶液、 0.1mol/L NaCl溶液、 30mmol/L Tris-HCl pH7的缓冲液。 0029 本实施例中， 洗脱液为pH8的HEPES缓冲液。 0030 实施例3 0031 取50 L的镍合-NTA纳米磁珠放入1.5mL离心管中， 将500 l结合液， 加入到镍合- NTA。

　　19、纳米磁珠中， 混合10次， 将上述离心管放在磁力架上进行吸附镍合-NTA纳米磁珠， 吸附 1min， 移出并弃掉上清液， 重复洗涤1次， 保留底部镍合-NTA纳米磁珠； 将1mL结合液和100 L His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原加入到镍合-NTA纳米磁珠的离心管中， 4混合反应 15min， 把离心管放到磁力架上吸附1min， 移出并弃掉上清液， 保留离心管底部的抗原-抗体 磁珠结合物A， 加入1mL洗涤液洗涤抗原-抗体磁珠结合物A， 混合均匀， 室温放置5min， 将离 心管放到磁力架上吸附2min， 移出并弃掉上清液， 重复1次， 得到离心管底部的抗原-抗体磁 珠结合物B， 将20。

　　20、0 L洗脱液加入到上述离心管中， 4下混合10min， 将离心管放到磁力架上 吸附2min， 得到纯化富集后的His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原上清液。 0032 本实施例中， 结合液为pH8的HEPES缓冲液。 0033 本实施例中， 洗涤液为pH7的HEPES缓冲液。 0034 本实施例中， 洗脱液为pH8的HEPES缓冲液。 0035 实施例4 0036 取50 L的镍合-NTA纳米磁珠放入1.5mL离心管中， 将500 l结合液， 加入到镍合- NTA纳米磁珠中， 混合10次， 将上述离心管放在磁力架上进行吸附镍合-NTA纳米磁珠， 吸附 1min， 移出并弃掉上清液， 重复洗涤1。

　　21、次， 保留底部镍合-NTA纳米磁珠； 将1mL结合液和100 L 说明书 3/5 页 5 CN 109851663 A 5 His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原加入到镍合-NTA纳米磁珠的离心管中， 4混合反应 15min， 把离心管放到磁力架上吸附1min， 移出并弃掉上清液， 保留离心管底部的抗原-抗体 磁珠结合物A， 加入1mL洗涤液洗涤抗原-抗体磁珠结合物A， 混合均匀， 室温放置5min， 将离 心管放到磁力架上吸附2min， 移出并弃掉上清液， 重复1次， 得到离心管底部的抗原-抗体磁 珠结合物B， 将200 L洗脱液加入到上述离心管中， 4下混合10min， 将离心管放到磁力架。

　　23、 从上图可以看出试验的重 复性很好， 纯化后只有一条明显的主带， 其他杂带比较弱； 根据纯化后各个条带的亮度可以 推算出镍合纳米磁珠法能够得到约90His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原的纯度； 通过 对比纯化前、 后主带的亮度可以推算出His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原蛋白得率约为 40。 另外图中比较暗的杂带可能是细胞内其他含组氨酸的蛋白非特异性地结合在镍合- NTA纳米磁珠上， 这里可以看到镍合-NTA方法本身的不足。 从试验流程上看， 整个纯化过程 简单高效。 0041 实施例5 0042 分别将镍合纳米磁珠法纯化的His-tag标记的口蹄疫表位蛋白抗原与镍合柱纯化 His-tag。

　　24、标记的口蹄疫表位蛋白抗原作对比， 详见表1。 0043 表1镍合纳米磁珠法纯化抗原与镍合柱纯化抗原的作对比 0044 镍合磁珠法镍合柱层析法 抗原回收率35-455-15 得到的抗原浓度10-205-8 所需抗原最小体积10-30 L500-1000 L 0045 由表1可知， 采用镍合纳米磁珠法纯化抗原的抗原回收率是镍合柱纯化抗原的回 收率3-7倍， 且镍合纳米磁珠法得到的抗原浓度是镍合柱得到的抗原浓度的2倍或以上， 采 用镍合纳米磁珠法纯化所需抗原最小体积是镍合柱的2-3。 0046 综上所述， 镍合纳米磁珠法纯化的抗原得率在40左右， 比常规的镍合柱层析法 高3-7倍， 浓度高2倍以上，。

　　25、 镍合纳米磁珠法纯化抗原具有得率高， 抗原浓度大， 易于下游的 应用等优势。 0047 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技 术人员而言， 显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在不背离本发明的精神或 基本特征的情况下， 能够以其他的具体形式实现本发明。 因此， 无论从哪一点来看， 均应将 实施例看作是示范性的， 而且是非限制性的， 本发明的范围由所附权利要求而不是上述说 明限定， 因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明 说明书 4/5 页 6 CN 109851663 A 6 内。 不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。 0048 此外， 应当理解， 虽然本说明书按照实施方式加以描述， 但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案， 说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见， 本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体， 各实施例中的技术方案也可以经适当组合， 形成本领域技术人员 可以理解的其他实施方式。 说明书 5/5 页 7 CN 109851663 A 7 图1 说明书附图 1/1 页 8 CN 109851663 A 8 。